cdna_cdna有没有内含子_cdna文库的构建方法

RACE。RACE是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDN段。利用锚式PCR。快速扩增cDNA末端从而获得已知mRNA内一段小序列与3‘或5’的cDNA序列技术。

中文名,RACE。1,通过PCR进行。2,cDNA末端快速克隆的技术。

简介。RACE是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDN段。通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和5端的方法。

发展简史。近年来随着生物技术的不断发展。

出现了许多获得新基因的方法和手段。如图谱技术。转座子标签技术。mRNA差异显示技术。二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长。技术步骤繁琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3’末端的有效方法。以其简单。快速。廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等发明的一项技术。

主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端。包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善。克服了早期技术步骤多。时间长。特异性差的缺点。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物合成第一链cDNA,即在oligo引物的3端引入两个简并的核苷酸【5-Oligo16_30MN-3, M=A/G/C;N=A/G/C/T】。

使引物定位在poly尾的起始点。从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo与poly尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时。采用poly。而不是poly;改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h 有效地逆转录mRNA。从而消除了5’端由于高GC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR 技术和降落PCR提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善。目前已有商业化的RACE技术产品和试剂盒推出。如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术。邢桂春等先后使用上述两种盒进行RACE反应。结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为。进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE盒。

以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE盒为例。简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly尾巴作为一个引物结合位点。以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物。用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物。以cDNA第一链为模板。

进行PCR循环。把目的基因3‘末端的DN段扩增出来。

优点。与筛库法相比较：1）此方法是通过PCR技术实现的。

无须建立cDNA文库。可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。2）节约了实验所花费的经费和时间。3）只要引物设计正确。在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。实验室现有的RACE试剂盒的简介™RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。

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