cdna_cdna有没有内含子_cdna文库的构建方法(3)

可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法。最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。{电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。{将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1。Srf1。Xma1。ECOR1等酶切位点。将产物克隆到常规载体中对于5‘端的RACE产物。我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。

{一旦鉴定了含有插入片断的克隆。应该获得多的序列信息。理想的是。可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。全长cDNA的获得{通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后。可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR的方法。通过克隆的方法。通过PCR的方法获得全长cDNA：„扩增长的cDNA需要较长的延伸时间。但是如果延伸的时间过长。可以产生拖带。所以要慎重的设计引物。„根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。

这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端。应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点。这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。通过PCR的方法获得全长cDNA：„进行如下的热循环：94度30秒25个循环94度5秒72度2－15分钟„延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带。cdna用6+2=8分钟的延伸时间。

„注意：如果没有条带或者条带弱。增加5个循环；或者优化PCR的条件。通过PCR的方法获得全长cDNA：„在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下。可以见到一条单一带。如果这样。利用胶来纯化全长的cDNA。„制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer。TBE的胶很难制备全长的cDNA。„将剩下的45μl反应物点样。选用适当的marker。„利用长波紫外观察cDNA切下全长的cDNA。

注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。通过PCR的方法获得全长cDNA：„利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段。可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法。最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。„将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。通过克隆产生全长的cDNA：z如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物。

同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话。通过克隆技术可以获得全长的cDNA。z利用酶切获得的3‘和5’扩增产物。并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。z在哺乳动物基因组中。NOT1和Srf1酶切非常稀少。大约106bp才出现一次。因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。Appendix：cDNA接头和引物z接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：z接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。

AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。z这些特点中的每一个都可帮助减少cDN段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外。它们允许从一个复杂的DN段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构。因为使用了单一的一套GSPs。

审计程序。RACE 这是在实施审计程序时必要的一个程序。

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