cdna_cdna有没有内含子_cdna文库的构建方法(2)

™使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息。以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物。引物的设计：基因特异性引物应该是：™23－28nt™50－70%GC™Tm值≥65度。Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物为了确定RNA样品中目的基因确实表达。利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。

实验步骤。①cDNA第一条链的合成：ƒ我们建议进行cDNA合成的对照反应。

这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后。在水浴中42度保温一个小时。注意：在水浴或酒精浴中保温会减少反应体积。从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上。以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。②cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中。含有聚合酶。RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。

我们建议做阳性对照。试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。ƒ建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。ƒ通过电泳检测cDNA的产量。与对照进行对比。这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。接头的连接及连接产物的稀释ƒ按照程序进行连接反应。ƒ如果没有对比样品和对照的产量。利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物。

用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应。直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。RACE－PCR扩增·进行5’和3’的RACE－PCR扩增。·利用以下的程序进行降落PCR反应：94度30秒5个循环：94度5秒72度4分钟5个循环：94度5秒70度4分钟20－25个循环：94度5秒68度4分钟注意：我们建议使用降落PCR反应。这就要求GSP的Tm值≥70度。当循环结束时。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl。

使用适当的分子量marker。·可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带。cdna在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候。经常使用4min。0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min。对于5－10kb的条带。延伸时间增加到10min。③RACE产物的验证：{应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。

如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员。验证是非常有用的。有3种验证RACE产物的方法：比较由GSP和NGSP获得RACE产物。Southern blot克隆并测序{我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物。{对于5‘末端的RACE产物。比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。{对于3‘末端的RACE产物。

比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。{如果条带是正确的。在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。④RACE产物的克隆和测序：{可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段。

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