cdna_cdna是什么_cdna文库

ds-cDNA。ds-cDNA是基因文库技术中。

通过mRNA反转录所获得的cDNA。依靠DNA聚合酶。在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。通过ds-cDNA的合成。可以得到源mRNA的双链cDNA模板。用于后续的酶切处理和基因文库的建立。

概念。ds-cDNA是基因文库技术中。通过mRNA反转录所获得的cDNA。

依靠DNA聚合酶。cdna在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。

合成方法。以下合成方法涵盖了ds-cDNA的基本合成手段。

具体操作中往往由于实验条件和所用试剂的不同。进行适当调整。1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl。100m mol/L甲基氢1μl。室温反应l0分钟。使RNA变性。2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl。室温放置5分钟。

β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。3)向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo dT10μl。1mol/L Tris.HCl5μl。11mol/L KCl7μl。250m mol/L MgCl22μl。再加20 m mol/L的4种dNTP各2.5μl。逆转录酶2μl。用水补充到50μl。充分混匀。42℃反应1～3小时。4)加0.5 EDTA2μl终止反应。然后加150m mol/L NaOH 25μl。

65℃反应1小时。或37℃8小时。水解mRNA模板。得到cDNA第一链。再加pH8.0。1m mol/L Tris.HCl。各25μl中和其pH。5)测定放射活性。计算合成的DNA量。实际上。cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%。6)用等体积的酚-氯仿抽提―次。取水相并用SephadexG-100离心柱层析将cDNA同剩余的dNTP分开。以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀。

7)合成的cDNA第―链在1.4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳。用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准。电泳后。铺X-光片。进行放射自显影。确定cDNA第一链的大小。1）第一链合成完毕后。直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入2.5×第二链缓冲液40μl。DNA聚合酶Ⅰ23μRNase H 0.8μ加水至100μl注：具体体系的配置。可依照实验用量和不同厂家的试剂酌情变更。

2）14-16℃下放置2小时。3）70℃。10min。点动离心,置于冰浴4） 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分钟。5）加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.6） 等体积加入酚\氯仿\异戊醇抽上清,12000g。3min。7） 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V。-20℃30min沉淀,12000g。15min收集沉淀。

70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。也可以选择试剂盒方法。cdna如Promega的Universal RiboClone cDNA Synthesis System。里面就包含从RNA反转录成cDNA第一链。以及合成cDNA第二链所需的试剂。

ds-cDNA是基因文库技术中，通过mRNA反转录所获得的cDNA（第一链），依靠DNA聚合酶，在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。

通过ds-cDNA的合成，可以得到源mRNA的双链cDNA模板，用于后续的酶切处理和基因文库的建立。

概念

ds-cDNA是基因文库技术中，通过mRNA反转录所获得的cDNA（第一链），依靠DNA聚合酶，在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。

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