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合成方法cDNA的合成

1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。

2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。

3)向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl，1mol/L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol/L KCl7μl，250m mol/L MgCl22μl，再加20 m mol/L的4种dNTP各2.5μl，逆转录酶2μl（40单位），用水补充到50μl，充分混匀，42℃反应1～3小时。

4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应，然后加150m mol/L NaOH 25μl，65℃反应1小时，或37℃8小时，水解mRNA模板，得到cDNA第一链，再加pH8.0，1m mol/L Tris.HCl，各25μl中和其pH。

5)测定放射活性，计算合成的DNA量。实际上，cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%。

6)用等体积的酚-氯仿抽提―次，取水相并用SephadexG-100离心柱层析(参看第6章)将cDNA同剩余的dNTP分开，以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀。

7)合成的cDNA第―链在1.4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳，用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准，电泳后，铺X-光片，进行放射自显影，确定cDNA第一链的大小。[1]

ds-cDNA的合成

1）第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入

2.5×第二链缓冲液40μl，

DNA聚合酶Ⅰ23μ（或者T4-DNA聚合酶）

RNase H 0.8μ

加水至100μl

2）14-16℃下放置2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时)

3）70℃，10min，点动离心,置于冰浴

4） 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分钟。

5）加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.

6） 等体积加入酚\氯仿\异戊醇抽上清,12000g，3min。

7） 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。[1]

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