色谱中常用的五种定量方法

经常需要在色谱和质谱法中定量目标物质. 目前，使用了更多的定量方法，例如面积归一化方法，单点校准方法，外标方法，内标方法和标准添加方法.

定量分析的基本要求:

1. 以纯物质为标准

2. 定量组分的峰必须与其他峰分开（可能无法满足质谱要求）

3. 符合定性参数要求

4. 选择合适的定量方法

定量分析的基本公式:

在某些条件下，被测成分的浓度与检测器的响应值成正比. （蒸发光散射检测器的浓度与峰面积不成线性关系，在分别取对数后变为线性）

Ci = fiAi或Ci = fiHi

Ci: 组分浓度

fi: 响应因子（与组件的物理和化学特性以及检测器的特性有关）

Ai: 组件响应区域

嗨: 组件响应高度

实际修改公式: Y = aX + b

1. 面积归一化方法

将所有峰成分的总和计算为100％的定量方法称为归一化方法. 当样品中的所有组分都可以从色谱柱中流出，并且可以在检测器上产生信号的样品时，可以通过归一化方法进行定量，并根据下式计算出组分i的质量分数:

归一化方法量化的主要问题是质量校正因子的确定更加麻烦. 尽管可以在文献中找到某些校正因子或通过某些计算方法进行计算，但要获得准确的校正因子，仍需要使用每种校正因子. 直接确定组分的参考物质.

某些气相色谱的主要检测器（例如FID和TCD）对某些成分（例如系列）具有相似的校正因子，或者具有某些规则，可以在文献中找到或计算得出. 当校准因子相似时，峰面积归一化可直接用于定量分析. 例如，下表给出了C8芳族异构体的分析结果. 四组分FID检测器的质量校正因子在0.96至1.00之间，所得结果直接给出了校正因子对定量方法的定量结果，对峰面积进行了归一化定量结果.

比较两个结果，误差很小. 在这种情况下，使用峰面积直接进行归一化非常方便，并且误差范围也允许这样做.

使用:

当用于杂质检查时，由于峰面积归一化方法的测量误差较大，因此该方法通常只能用于粗略地检查被测产品中的杂质含量.

除非另有说明，否则通常不适用于痕量杂质的检查. 它不能用作精确的定量方法，而只能在特定情况下使用.

功能:

1. 无需校准（无标准曲线）

2. 注射量不是严格要求的

3. 所有成分都必须流出并被检测出

4. 所有组件的响应因子都必须相等

5. FID可用于更正响应差异

6，假设所有fi都相同

Wi％= mi /（m1 + m2 + m3 + ... + mi + ...）* 100％== Ai /（A1 + A2 + A3 + ... + Ai + ...）* 100％= Ci％

二，外标法

使用待测成分的纯产物作为参比物质并将参比物质与待测成分在样品中的响应信号进行定量的方法称为外标法. 该方法可以分为工作曲线法和外标单点法. 工作曲线法是用参考物质配制一系列浓度的参考溶液来确定工作曲线，求出斜率和截距.

在完全相同的条件下，准确注入与参考溶液相同体积的样品溶液. 根据待测组分的信号，从标准曲线中找到其浓度，或使用回归方程进行计算. 工作曲线法也可以使用外部标准两点法. 通常，截距应为零，如果不等于零，则存在系统错误. 当工作曲线的截距为零时，可以使用外标一点法（直接比较法）进行定量.

外标单点法是将样品溶液中成分i的含量与参考溶液的浓度进行比较. 在相同条件下多次注入参考溶液和样品溶液，并测量平均峰面积. 通过以下公式计算样品中i的含量:

W = A（W）/（A）

W和A分别代表样品溶液的注射体积中所含的组分i的重量和相应的峰面积. （W）和（A）分别代表参比溶液注射量中纯产品i组分的重量和相应的峰面积. 外标方法很简单，不需要校正因子. 无论样品中的其他组分是否具有峰，都可以对要测试的组分进行定量. 但是，该方法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响. 另外，为了减少外标单点法的实验误差，配制的参考溶液的浓度应尽可能接近样品中各组分的浓度.

外标法外标法色谱分析中的定量方法. 它不会将标准物质添加到测试样品中，而是在与测试样品相同的色谱条件下进行单独测定，并将获得的色谱峰与所测组分的色谱峰面积进行比较，从而得出被测成分的含量.

外标物质和被测成分是同一物质，但必须具有一定的纯度. 分析过程中外标物质的浓度应与被测物质的浓度接近，以利于定量分析的准确性.

Ci = fiAi + b标准曲线拟合公式，fi -i分量工作曲线斜率

功能:

1. 实验室中最常用的定量方法，定量结果更准确

2. 不必洗脱或检测所有峰，只需校正目标组分

3. 需要标准产品

4. 进样量必须准确

5. 仪器必须具有良好的稳定性

6. 每个样品分析的色谱条件（检测器响应性能，色谱柱温度，流动相组成和流速，进样量，色谱柱效率等）很难完全相同，因此容易出现大的误差

7. 在样品预处理过程中不可能补偿被测组分的变化

三，单点校正方法

当试样中各成分的浓度变化不大时，无需绘制多点标准曲线，而使用单点校正法（直接比较法）. 根据被测组分与外标组分的峰面积比或峰高比，准备接近被测组分含量的标准溶液，定量注入并计算被测组分的含量.

Wi = fiAi，WS = fSAS，fi = fS

Wi / WS = Ai / AS

经过i测试的组件； S标准解决方案组件

问题:

单点校准方法实际上是将原点用作标准工作曲线上的另一个点. 因此，当该方法具有较大的系统误差（即标准工作曲线未通过原点）时，单点校正方法将具有较大的误差.

四种内标方法

内部标准方法是间接或相对校准方法. 在分析和确定样品中某些成分的含量时，要添加内标物质进行校准，以消除操作条件波动对分析结果的影响，从而提高分析结果的准确性.

内标法是气相色谱定量分析中的重要技术. 使用内标方法时，只要将内标物质的峰面积加到样品中，即可通过色谱柱分离出一定量的标准物质，而不会受到样品中其他组分峰的干扰并利用相对响应值测量被测组分，可以计算出样品中被测组分的百分比含量. 当使用内标法进行定量时，内标的选择是非常重要的任务.

理想地，内标应该是可以得到纯样品的已知化合物，以便可以准确和已知的量将其添加到样品中，并且其基本与被分析的样品相同. 或尽可能一致的物理和化学特性（例如化学结构，极性，和在溶剂中的溶解度等），色谱行为和响应特性，最好是分析物的同系物.

当然，在色谱分析条下，必须将内标与样品中的组分充分分离. 应该指出的是，在某些情况下，分析人员可能会更担心复杂过程中化合物的回收率. 此时，他可以使用在此过程中很容易完全恢复的化学平台. 它用作内标以确定目标化合物的回收率，而无需遵循上述选择原则.

使用内标法进行定量时，哪些因素会影响内标与被测组分的峰高或峰面积之比？

影响内标物和被测组分的峰高或峰面积比的因素主要是化学的，色谱的和仪器的.

在分析重复样品时，经常会由于化学原因而导致面积比变化.

化学因素包括:

1. 样品中的内标混合不充分；

2. 内标物质与样品成分之间发生反应，

3. 内标纯度可变等.

对于更成熟的方法，色谱问题更可能发生. 一些常见的色谱问题（例如泄漏）对绝对面积有较大影响，而面积比更小，但如果绝对面积变化大到足以引起面积比显着变化，则必须存在一个重要的色谱问题. 例如，进样量变化太大色谱分析法，样品成分浓度和内标浓度在检测器之间存在较大差异，非线性等. 进样量应足够小并保持恒定，以免引起饱和检测器和集成设备的外壳.

如果该方法可靠，并且色谱图似乎正常，请检查积分装置和设置，斜率和峰宽定位. 怀疑该集成装置的最有力证据是面积比可变，而峰高比保持相对恒定.

制作内标标准曲线时应注意什么？

使用内标法进行颜色定量分析时，首先要按一定的重量比准备被测成分与内标样品的混合物，进行色谱分析，测量峰面积，绘制重量比之间的关系曲线. 和面积比. 曲线是标准曲线.

实际样品分析中使用的色谱条件应与制备标准曲线时使用的条件尽可能一致. 因此，在制备标准曲线时，不仅要说明色谱条件（如固定相，色谱柱温度，载气流速等），还应指出进样量和内标浓度.

绘制内标标准曲线时，每个点不会完全落在一条直线上. 此时，应获得面积比和重量比之比与其平均位置之间的标准偏差，并且在使用过程中应定期进行单点校准. 如果获得的值与平均值之间的偏差小于2，则仍可以使用曲线. 如果大于2色谱分析法，则应重绘曲线. 如果曲线在短时间内发生变化，则内标法不适合定量.

内标方法的关键是选择合适的内标.

样品制备: 准确称量一定数量的样品Wi，并添加一定数量的内标WIS

Wi = fiAi，WIS = fISAIS

Wi = fiAi / fISAIS * WIS = fi'Ai / AIS * WIS

fi'是组分i对内标IS的质量校正因子

如果CIS减小为1，则横坐标可以直接读取目标浓度值Ci

功能:

1. 主要用于具有更严格的国际标准和法规的方法

2. 内源性化合物在临床测试中有许多应用

3. 样品量的变化和色谱条件的微小变化对内标方法的定量结果影响很小

4. 在样品预处理之前添加内标（例如浓缩，萃取，衍生化等）可以部分补偿所测组分样品预处理过程的损失

5. 样品中必须添加相同量的相同内标

6. 操作比较麻烦

7. 很难选择内标物质

内部标准选择:

1. 样品中不存在它，并且其理化性质与分析物一致

2. 与样品中的成分无化学反应

3. 内标物与分析物的反应相似.

4. 内标物和分析物可以很好地分离而不会相距太远（质谱法同位素内标物除外）

5. 内标物与分析物的峰面积比最好在0.7-1.3之间（内标物的添加量取决于被分析物的浓度）

6. 常用的内标包括质谱中常用的同系物和同位素内标，例如氘代内标

第五，标准连接方法

标准添加方法可以看作是内部标准方法和外部标准方法的组合. 当未选择合适的内标物质或没有空白样品时，将待测组分的纯物质作为内标物质添加到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，将纯物质在样品中添加待测组分的峰面积（或峰高），以计算样品中待测组分的含量.

具体操作是取待测样品的多个相等部分，添加不同浓度的待测组分的标准溶液进行分析，并绘制浓度为横坐标和峰值的工作曲线面积为纵坐标. 工作曲线的延长线在横坐标上的截距是样品中待测组分的浓度. 由于测试成分和添加的标准溶液在同一样品基质中，因此等效于将测试样品用作背景值.

但是，由于每个样品必须制备三种以上的混合溶液，其中包括样品溶液和标准溶液，因此该方法不适用于分析大量样品.

Wi + W add = fi'Ai'

当fi = fi'时，（Wi + W加）/ Wi = Ai'/ Ai，即Wi = W加/（Ai'/ Ai-1）

功能:

1. 只需测试成分的纯净物质，而无需选择内标物质.

2，进样量必须准确

3. 两种色谱条件完全相同，以确保校正因子完全相同

4. 如果在样品预处理之前添加已知量和准确量的待测组分，则可以补偿预处理过程中待测组分的损失，这是色谱分析中更常用的定量分析方法<

5. 缺点是在添加被测成分前后两种色谱条件完全相同，以确保两次测定中的校正因子完全相等，否则会引起分析和测定误差.

外标法的应用可以满足要求，首选外标法，毕竟外标法简单方便. 仅考虑精度，但不考虑其他成本和效率因素，内标法优于外标法. 当结果的准确性和准确性较高时，仍需要使用内标法.

内标和外标都是定量方法，各有优缺点. 有必要综合考虑分析领域，分析要求以及分析成本和分析效率，选择一种定量方法，以找到一种简单有效的定量分析方法.

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