介绍米根霉生长环境对有机酸产生的影响机理

南京林业大学毕业设计（论文）开题报告学生姓名指导老师姓名职务职务来源职务职务李新学职务职称科研项目120204111副教授大学选定类型生物工程化学工程院学位论文水稻根霉的生长目的和意义环境对有机酸生产影响机理的研究以米根霉为起始菌株，研究米根霉从葡萄糖生产有机酸的过程，发酵条件变化对有机酸生产的影响，并研究米根霉的生长. 环境变化对米根霉的影响有机酸的生产为通过生物转化制备有机酸提供了数据基础. 类似研究概述作为一种重要的四碳平台化合物，富马酸已被列为美国能源部优先开发的十二种平台化合物之一. 已经成为我们迫切需要解决的问题. 以米根霉为起始菌株，研究了pH变化对米根霉生产富马酸和L-苹果酸的影响，并优化了米根霉发酵酸的发酵条件. 研究内容和计划2016.1-2016.3 2016.4-2016.5 2016.5-2016.6文献检索，数据准备，开幕报告和探索性实验循序渐进的实验补充实验，论文和论文的防御特性与创新1，根霉发酵条件的研究稻谷富马酸生产的影响. 2.讨论诱变条件引起富马酸产量变化的原因.

导师的意见导师的签名: 年月日第1研究背景随着科学技术和社会进步的不断发展，人类越来越重视自身的生活环境和资源利用，特别是食品安全. 问题和石油资源开发问题与人类的长期发展密切相关，这不得不提到富马酸. 富马酸作为重要的四碳平台化合物之一，已被美国能源部列为要优先开发的十二种平台化合物之一[1]. 富马酸，也称为富马酸或反丁烯二酸，是生物体内重要的中间代谢产物. 此外，它还用于医药，涂料，树脂和增塑剂. 它在其他领域也起着重要作用. 它甚至是重要的有机化学原料，可用作食品添加剂和饲料添加剂. 富马酸具有纯正的味道米根霉，其酸度恰好是柠檬酸的1.5倍. 它不仅没有毒性和副作用，而且在防腐剂和抑菌剂中也起着重要的作用. 它是近年来最新的食品调味剂之一. 通过富马酸的酶促转化可以制得L-苹果酸和L-天冬氨酸，这两种都是重要的食品添加剂，尤其是L-苹果酸，目前世界上排名第一. 酸味剂具有广阔的发展前景. 随着化石资源日益枯竭的发展，利用可再生生物资源制备富马酸的研究已成为我们的必由之路.

由于世界粮食价格比前几年上涨，因此通过发酵生产富马酸的方法的成本相应增加，因此寻找一种廉价的制备富马酸的方法已成为我们迫切需要解决的问题. . 2文献综述2.1富马酸的结构和理化性质富马酸是最简单的不饱和二元羧酸. 其结构式如下图所示. 它具有两个羧基和一个双键. 其分子式为H4O4，分子量为116.07. 富马酸为白色颗粒，结晶，微酸，无毒，易燃，在空气中稳定，密度1.635 g / cm3，熔点299〜300℃，在290℃升华，富马酸易溶于乙醇溶液，微溶于水和，几乎不溶于二氯甲烷. 其中，在水中的溶解度为0.63 g / 100 mL，富马酸为富马酸[2]，它是与马来酸的几何异构体，可通过加热至250-300℃将富马酸转化为马来酸，富马酸. 也可以通过高锰酸钾的氧化生成外消旋酒石酸. 图1富马酸的结构式2.2富马酸的用途富马酸在医药，涂料，树脂，增塑剂，食品添加剂和饲料添加剂中具有重要的应用. 在医学上，富马酸酯可用于治疗严重的牛皮癣，还可以预防多发性硬化症，还可以用于生产解毒剂二磺酰琥珀酸，其反应产物还可以用于治疗小红细胞性贫血，富马酸酯对人体健康非常有益.

它可以改善牛皮癣的症状，并且人类皮肤在阳光下自然可以产生富马酸. 富马酸酯经常与左旋肉碱一起使用，以帮助人体产生对我们有益的物质. 此外，富马酸盐对运动的恢复有一定作用. 在涂料中，它是生产电泳漆的原料. 它可以生产具有优异的耐热性和耐化学腐蚀性的不饱和聚酯树脂，工业级的富马酸可以生产醇酸树脂. 富马酸和乙酸乙烯酯的共聚物也可以用作实用的粘合剂. 富马酸和苯乙烯的共聚物也可用于制造玻璃钢. 由富马酸制成的增塑剂无毒. 醋酸乙烯酯乳胶与食品需要接触使用. 富马酸酯还可以使染料容易粘附在织物上，从而制成服装和毯子[3]. 富马酸在食品中的应用特别广泛，具有广阔的发展前景. 通常，富马酸可用作酸度调节剂，酸化剂，抗氧化剂助剂，固化促进剂，香料，发酵粉等. 富马酸可用作食品添加剂的一种酸味剂. 它在我们的日常生活中被广泛使用，例如凉茶饮料，果糖，果冻和布丁产品，冰淇淋产品，富马酸和柠檬酸味相似. 与NaOH反应生成的一钠盐也是酸味剂. 另外，它也可以用于肉和鱼产品的加工. 富马酸与NaCO3反应生成的富马酸钠是独特的增味剂，也是木糖醇生产中的重要组成部分.

2.3富马酸的制备方法目前，富马酸的制备方法主要条件简单，适应性强，生长快，适合实验室研究等质量好[4]. 本实验旨在研究米根霉对富马酸生产的影响. 2.3.1方法富马酸的方法又分为顺丁烯二酸酐（顺丁烯二酸酐）异构化法和糠醛氧化法. 前者对合成树脂，涂料，农药，润滑剂，医药产品，纸张处理剂，食品添加剂，稳定剂等有大量需求. 该方法以马来酸酐为原料，苯法和正丁烷法为原料. 主要方法它是KBr-H2O2系统，产率为93％. 它具有剂量低，运输方便和无腐蚀设备的优点. 缺点是石油资源短缺[5]. 糠醛是通过水解农林副产品获得的有机化学原料. 它具有广泛的覆盖范围. 在生活中，它在医药，农业，纺织，颜料，塑料，绝缘材料，胶粘剂，食品添加剂，合成树脂和橡胶方面拥有非常好的产业. 广泛使用. 它使用糠醛为原料，将植物纤维原料进行水解和纯化，并使用V2O5作为催化剂. 其产率为83％. 它具有低污染和可回收的副产品肥料的优点. 缺点是成本高.

制得的富马酸面临的最大问题是资源的腐烂速度快于我们对石油资源的开采，并且环境压力也在增加. 我们在利用资源生产富马酸的同时，还产生了巨大的污染，这破坏了生态平衡. 2.3.2生物合成方法富马酸的生物合成方法分为酶催化转化法和微生物发酵法. 酶催化的转化方法通常使用马来酸作为底物在马来酸异构酶的催化作用下产生富马酸. 该方法具有高转化效率和高产率. 微生物发酵法主要通过霉菌发酵生产富马酸，但是由于早期技术水平不够，人们不了解微生物的生长和代谢. 这就是工业生产的实际可行性落后的原因. 加上石油危机的加剧，人们更加重视微生物发酵制备富马酸的研究. 可用于制备富马酸的微生物是霉菌，酵母菌和细菌. 其中，米根霉是富马酸发酵中常用的菌株之一. 米根霉具有转化淀粉糖的能力，所需的发酵营养成分简单，适应性强，生长快，菌丝体和发酵液易于分离，提取容易，产品纯正. 在该实验中，米根霉产生富马酸[6]. 2.4米根霉的生产富马酸2.4.1米根霉在米根霉真菌中的主要有近缘真菌，近缘真菌，粘藻科，粘菌科，根霉. 菌落松散或密集，首先出现白色，然后变成灰色（黑色）棕色. 菌丝体蠕变，无色，米根霉的根茎发达，分支呈手指状或根状，褐色.

水疱蒂直立或稍弯曲，与假根相反，有时扩大或分枝，棕色，长210-2500μm，直径5-18μm. 囊的轴为球形或近球形或椭圆形，浅棕色，直径为30-200μm. 囊是楔形的. 子囊为球形或近球形，老龄为黑色，直径为60-250μm. 要求，菌丝大且易于分离. 它对富马酸的纯化具有重要作用. 它是目前研究的发酵发酵菌株[7]. 米根霉是在土壤和空气中常见的中药和葡萄酒的重要霉菌. 它可以糖化淀粉，将蔗糖转化为乳酸，富马酸和微量酒精. 它还具有很强的淀粉酶活性，常用于酒精和大豆产品的发酵. 图2米曲霉2.4.2米曲霉生产富马酸的代谢途径富马酸是TCA周期的中间产物，而富马酸在米根霉的代谢过程中是通过其他途径积累的. 米根霉在葡萄糖代谢模型中具有两个富马酸合成途径. 一种是通过线粒体中的三羧酸循环. 琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的作用下产生富马酸. 富马酸可以通过转运系统通过线粒体膜进入细胞质，也可以被富马酸酶催化继续在反应下生成苹果酸.

细胞液中存在另一种途径. 酸羧化酶是TCA还原途径中的关键酶之一. 它催化固定化的二氧化碳与酸的反应生成草酰乙酸. 苹果酸脱氢酶中存在草酰乙酸. 在苹果酸的作用下，富马酸酶催化苹果酸生成富马酸[8]. 分析了两种方法. 后者的富马酸的理论产率比线粒体途径的理论产率高得多. 不难看出，胞质途径是富马酸的主要合成途径. 为了提高富马酸的实际产量，我们需要增加胞质途径的代谢流量. 此外，我们不能过多地减少线粒体途径，因为线粒体途径产生的能量占细胞生长和合成所需能量的绝大部分. . 图3米根霉中富马酸的代谢途径. 因此，我们需要确保足够的能量，合理地调节代谢网络，并增加细胞质途径的代谢通量，以获得更高的转化率. 2.4.3米根霉发酵条件的优化2.4.3.1发酵时间在不同时间发酵后，米根霉产生的富马酸的产量在约120小时后趋于稳定，富马酸的合成速率大大降低. ，因此可以确定. 米根霉的最佳发酵时间约为120小时[9]. 2.4.3.2碳和氮源碳源: 微生物对碳的需求很大，因为细胞中干物质中的碳约占一半，从简单的无机物（如CO2和碳酸盐）到糖衍生物和脂肪，这些复杂的有机物含碳化合物可用作微生物的碳源.

水稻根瘤菌是一种异养微生物，可以使用多种有机化合物作为碳源. 研究人员使用单因素方法测量了8种碳源（例如葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖和可溶性淀粉）对米根霉产生的富马酸含量的影响，最后得出结论，当可溶性淀粉被用作米粉时，碳源中，丰富的马酸产量最高. 氮源: 氮源是微生物合成氨基酸，蛋白质，核酸和细胞质的主要营养成分，是微生物生命活动中不可或缺的一部分. 可以在培养基中使用的氮源通常分为有机氮源（酵母提取物，蛋白ept等）和无机氮源（尿素，硫酸铵）等. 研究人员发现，酵母粉，蛋白ept，牛肉提取物，柠檬酸铵等. 氮源和氮源浓度对米根霉生长环境中富马酸生产的影响. 当氮源是蛋白ept时，富马酸的收率最高[10]. 可以得出结论，以可溶性淀粉为碳源，氮源为蛋白ept时，米根霉是最佳的富马酸生产条件，富马酸的产量为45 g / L. 2.4.3.3温度是重要因素影响微生物酶活性，温度和温度会影响米根霉代谢产物的积累. 通过考察不同温度对米根霉生产富马酸的影响，得出最佳发酵温度为28℃. 在此温度下，富马酸的产量最高，达到42 g / L. 2.4.3.4 pH pH是影响微生物生命活动和正常生长的重要条件. 它还会影响酸性发酵产物的积累. Taos等. 研究了不同pH值对米根霉的影响以及富马酸的产生的影响.

结论是，米根霉发酵的最适pH约为6.5，富马酸的产量最高，为43 g / L. 2.4.3.5在诱导实验中，我们还可以增加富马酸的含量通过添加诱导剂，米根霉产生的酸. 我们可以添加不同体积分数的苹果浸出液. 当向米根霉培养基中添加2％苹果浸出液时，富马酸的产量增加了4 g / L，增加了10％，还可以添加不同浓度的L-苹果酸. 向发酵培养基中添加1.5 g / L的L-苹果酸可使富马酸的产量提高5 g / L，增加13％. 可以看出，添加诱导剂对米根霉的富马酸生产具有显着影响. . 2.4.3.6在发酵过程中，随着反应的进行，酸继续积累，培养基中的pH值持续降低，约24小时后可降低至3以下，米根霉不能忍受高浓度. 酸. 严重影响了米根霉的菌丝生长和酶活性，但我们可以通过添加中和剂和中和溶液的pH值来解决此问题. Taos等. 研究了碳酸钙，碳酸氢钠，氢氧化钙和其他中和剂对米根霉生产富马酸的影响，结果表明，向发酵液中添加过量碳酸钙时，富马酸的产量最高，达到37 g / L，效果明显. 2.4.4影响富马酸收率的因素2.4.4.1溶液的pH溶液的pH对发酵产生的米根霉的形态和生物量的影响.

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