显微镜的原理和用途

光学显微镜的原理和应用简介1.光学显微镜的历史和最新发展已有近400年的历史. 在19世纪之前，发展非常缓慢. 1665年: 英国物理学家R. Hoock的第一台显微镜的原型. 十八世纪初: 惠更斯目镜的发明. 十九世纪中叶: 李斯特（Lister）和阿米奇（Amici）制造消色差物镜，部分消除了色差. 后者首先制成数值孔径为NA1的水浸物镜. 1886年: 恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）和卡尔·蔡司（Carl Zeiss）率先产生复消色差物镜消除了球差和色差的干扰，提高了数值孔径（1.4），奠定了显微镜，像散透镜，双目目镜和第一台立体显微镜的诞生. 20世纪初: 共聚焦物镜出现. 1932年底: 透射电子显微镜诞生. 电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的1000倍以上. 1930-1940年: 微型分光光度计的出现预示着微型量化技术的开始. 1940-1950: 出现了荧光显微镜. 第二次世界大战之前: 蔡司根据诺贝尔奖获得者荷兰物理学家弗里茨·泽尼克的光学理论，制造了第一台用于观察活细胞的相衬显微镜.

1955年: 物理学家乔治·诺马斯基（Georges Nomarski）改进了沃拉斯顿棱镜，并诞生了另一种增强活细胞对比技术的显微镜-诺玛斯基干涉显微镜或微分干涉对比显微镜. 1975年: 罗伯特·霍夫曼（Robert Hoffman）还提出了一种增强活细胞对比度的技术，即霍夫曼调制相衬显微镜. 1970-80: 医学图像处理和分析系统1970-80: 流式细胞仪1980-90: 激光扫描共聚焦显微镜诞生. 与普通光学显微镜相比，分辨率提高了1.5倍. 1980年代末和90年代初: 两光子扫描显微镜诞生了. 从1990年代后期到现在: 全内反射显微镜，物镜的数值孔径已达到1.6. 分辨率: 普通光学显微镜: xy- 0.25 m共焦显微镜: xy- 0.18 m，z- 300nm全内反射显微镜: z- 100nm 4pi: z 100nm STED: xy- 20nm透射电子显微镜: xy- 0.1nm二，主要生物光学显微镜物种: 光谱透射光显微镜: 观察组织化学染色的样品. 暗场显微镜: 适用于观察未染色的标本活细胞. 散射光成像. 相衬显微镜: 适用于观察活细胞. 光学相位差被转换为振幅差. 微分干涉对比显微镜: 适合观察活细胞.

使用双光束偏振光的干涉来增强对比度. 荧光显微镜: 观察标有荧光探针的样品（活细胞或固定样品）. 偏光显微镜: 使用偏光观察晶体结构或具有双折射的结构，例如: 细胞骨架，纤维，膜. 霍夫曼调制相衬显微镜: 观察活细胞. 光学显微镜的基本组成光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成. 光学成像: 物镜，目镜，照明系统，滤镜系统机械结构: 镜座，镜臂，镜架，镜筒，物镜转换器，聚焦装置光学成像部分: （1）物镜1.组成和功能: 由凹凸透镜组成，可直接将样品制成放大和倒置的真实图像（放大1100倍）. 物镜的质量和不同等级决定了整个显微镜的质量. 2.分类1）按不同的介质分类: 干物镜（简称: 干镜）（空气n = 1）油浸物镜（简称: 油镜）（油n = 1.515）水浸物镜（简称: 水）镜）（水n = 1.333）2）按校正像差分类: 消色差物镜（计划物镜）计划消色差物镜（计划复消色差物镜）计划消色差物镜（计划复消色差物镜）3）根据工作距离的长工作距离物镜普通工作远距物镜4）按功能分类相差物镜偏光物镜微分干涉差物镜5）按镜筒长度分类有限物镜无限物镜（2）目镜的组成和功能: 由凹面和凸面组成组成以将由物镜形成的反向实像放大为虚像1 0-16次.

根据目镜的视野，它可以分为: 非广角目镜，广角目镜，超广角目镜等. 对于10倍目镜，视场<18mm，通常称为非广角目镜. 视场≥18mm，通常称为广角目镜. 视场> 20mm，通常称为超广角目镜. （3）照明系统视场光阑2.聚光器3.光源1.视场光阑视场光阑通常位于支架的基座上. 隔膜的尺寸可以连续变化. 通过聚光镜可以清晰地将其成像在样品表面. 因此，当您在目镜中清楚地看到样本时，您还可以看到视场光阑的多边形或圆形图像. 应将可变视场光阑的图像从目镜中的视场光阑上切下，以便光只能照亮要观察的样本，并应尽可能减少样本周围的散射光. 2.聚光镜（装置）的组成和功能: 由前镜，可变光圈的光圈组成. 功能是改变入射光的强度，调整光束的大小，使光源发出的光形成适合物镜数值孔径的光束，从而达到目的. 均匀照射样品. 可变孔径光阑可变孔径光阑是冷凝器中非常重要的设备. 由于每个物镜的数值孔径是不同的，因此需要相应地改变照明光束的孔径角. 因此，必须有一个可以连续改变虹膜光圈的照明光圈角度的聚光镜，该光圈是可变光圈光圈. 3.光源1）照明光源: 自然: 人造太阳光: 卤素灯，高压汞灯，氙气灯2）照明方法: 透射照明和落射照明的介绍I）透射照明: 光源来自下方样品，通过样品到达物镜，然后透射照明光源. 通常使用卤素灯.

目前最常见的透射照明方法: 科勒照明II）落射照明: 光束通过物镜入射到样品上显微镜物镜工作距离，然后物镜收集反射光，然后成像. 物镜本身起聚光镜的作用. 主要用于荧光显微镜，反射光显微镜和偏振光显微镜. 荧光显微镜通常使用高压汞灯或氙气灯作为光源. （四）滤镜系统1.常用滤镜分为三类: 日光滤镜: 用于校正色温，将显微镜光的色温转换为（DFL）日光的色温，并恢复正确彩色照片. 中性滤光片: 减弱光源的光，对波长没有选择性，并且不改变色温（N4）. 补偿滤镜: 如果染料是红色，则可以使用绿色滤镜提高对比度. （绿色）2.有关荧光滤光片的详细信息，请参见第四节（荧光显微镜）第一节. 透射光显微镜1.光路结构和原理第一部分. 透射光显微镜1.成像: 物体形成倒置的放大实像物镜后面（此图像在目镜的焦点内）. 通过目镜形成一个放大的倒置虚像（该图像在眼睛的明场的25厘米之内）. 晶状体成为视网膜上的直立图像. 2.焦点: 凸透镜和凹透镜的焦点，凸透镜为真实焦点，凹透镜为虚拟焦点. 3.平行于光轴的镜头成像入射光的基本特性通过镜头的焦点出射. -穿过焦点的入射光平行于透镜的光轴出射. -入射光通过透镜轴的方向不变. 4.有限的远光路特性: 1）物体在物镜的前焦点之外2）非平行光路3）镜筒长度: 距物镜后焦平面的距离（160毫米）到目镜的前焦平面.

5. 无限远校正显微镜的光路（Zeiss，于1824年提出； 1980年后应用）特点: 1）物体位于物镜的前焦平面上2）是平行光路3）两个物镜的性能带镜筒的镜头1. 数值孔径NA数值孔径是物镜的最重要参数之一. 它直接影响物镜的分辨率和物镜的亮度. NA = nSin un: 物镜和样品之间的介质的折射率u: 1/2孔径角，进入物镜边缘的入射光束与物镜的光轴之间的夹角增加u， n，可增加NA干物镜: 介质为空气n = 1 NA: 0.05〜0.95浸水物镜: 介质为水n 1.33 NA: 0.7〜1.25油浸物镜: 介质为镜片油（雪松油）n 1.5 NA : 0.85〜1.4工作距离: 物镜前透镜距样品的距离为工作距离. 大. 距离越短，u越大，NA越大，物镜的最大数值孔径通常为1.4，但是现在有一种特殊的物镜，其数值孔径可以达到1.6，这种物镜是用于全内反射显微镜. 2.分辨率（分辨率乘方R）区分物平面上两点之间的最小距离是分辨率距离或分辨率，它表示分辨精细结构的能力. R = 0.61 / NA（R = 0.61 / 2 NA）λ: 光波的波长（通常为λ= 550nm）NA: 如果物镜的数值孔径为NA = 1.4，波长: 550nm，则R = 0.61×0.55 /1.4=0.24μ0.25μ是光学显微镜的极限分辨率. 数值孔径越大，波长越短，分辨率值越小，显微镜的分辨率越高.

I ＝ 26.4％d ＝ 0.61 / NA光学极限分辨率由光的衍射特性决定. 倍率（倍率M）倍率（M）=物镜倍率（M1）×目镜倍率（M2）物镜倍率: M1 = / F1有限的远光路::镜筒长度，物镜后焦平面至目镜前焦点F1表面的: 物镜的焦距. 无限远光路: : 镜筒透镜的焦距（160毫米）. 目镜放大倍率: M2 = 250 / F2 250mm: 眼睛与物体之间的距离，F2: 目镜的焦距. M2的放大倍率不超过16倍. 4.景深焦点深度DF景深表示清晰图像平面可以对应的物平面前后的空间深度. 或指的是焦点与样本上的某个点重合时在上，下侧的点和结构，那么，透明部分的厚度就是景深，也称为焦点深度. DF = 1 / 7NA * M +λ/ 2NA2其中: DF: 景深NA: 数值孔径NA M: 总放大率λ: 光波的波长，单位: mm注: 放大率越大，数值孔径越大，显微镜的景深越大越小. 5.反射镜亮度（图像光，L）反射镜亮度与数值孔径的平方成正比，与总放大倍数的平方成反比. L = NA2 / M2，M2 =（M1×M2）2注: 在相同放大倍数下，选择数值孔径不同的物镜，其镜像亮度会有所不同.

数值孔径越高，图像亮度越高. 当数值孔径相同或相位差不大时，物镜放大率越高，图像亮度越暗. 当观察荧光样品时，这一点尤其重要. 我们应该权衡适当目标的选择. NA对于荧光图像的亮度特别重要. 6.物镜的工作距离越长，NA越小. 当以相同的放大倍率观察共聚焦的厚样品时，当数值孔径接近时，应选择工作距离较长的物镜进行观察. 63x / 1.32机油L: 0.07mm 63x / 1. 2 w L: 0.22mm聚光镜的组成和功能: 由前透镜和可变孔径光阑组成. 其功能是改变入射光的强度，调整光束的大小，以使光源发出的光形成适合于物镜数值孔径的光束，从而均匀地照亮标本. 可变孔径光阑可变孔径光阑是冷凝器中非常重要的设备. 由于每个物镜的数值孔径是不同的，因此需要相应地改变照明光束的孔径角. 因此，聚光镜中必须有一个可以连续改变照明孔径角的透镜. 虹膜光阑，此光阑是可变孔径光阑. 冷凝器分为干式和湿式. 所谓“湿”是指在使用过程中需要滴入浸液. 这种冷凝器的NA为1.2-1.4. “干燥”使用不需要滴液，NA通常为0.9. 徕卡也有干式和干式冷凝器，NA 0.9 / NA 1.25. 数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100x油镜配合使用，其分辨率不会降低.

由于可变孔径光阑的尺寸可以是物镜数值孔径的2/33/4，即1.25 * 3/4 = 0.94，因此NA0.9干式聚光镜正适合于此，而且还避免了操作员滴油. 和清洁的麻烦. 对于特别要求识别率的场合，应使用湿式冷凝器. 使用时，应将相应的浸液滴到载玻片和冷凝器的上表面. 科勒照明: 这是一种更完整的照明方法，目的是获得最佳的对比度和最清晰的图像. 严格的科勒照明必须满足以下三个条件: -即使照明，灯丝图像也位于聚光镜的前焦平面上，并且聚光镜用平行光束照明样品. －光圈尺寸可以任意改变，以满足不同放大倍率的需要. －它具有可变视场光阑，可以满足不同放大倍率物镜的不同照明范围的需要. 第二节物镜的分类和标记1.物镜的分类（1）根据像差校正的程度进行分类: 1.消色差物镜校正两种颜色的球差，彗差和色差. 这些物镜具有严重的轴约为50％，即在清晰调整视场中心后边缘图像模糊，否则，边缘图像为清晰调整边缘图像后模糊. 物镜外壳上没有特殊标记. Leica BME和DME显微镜的物镜是这种类型的. 这种物镜是最低的物镜，适合于普通的明场观察. 2.计划消色差物镜. 基于消色差物镜，它还可以校正像散和场曲，并且像平面是平坦的.

清除范围不小于90％. 物镜介于消色差物镜和平面消色差物镜之间，但显然优于消色差物镜. 接近计划消色差物镜. 外壳通常刻有C PLAN. 4.平场复消色差物镜的色差校正度在平场消色差物镜和平场复消色差物镜之间. 但这更接近计划的复消色差目标. 物镜外壳上刻有PL FLUOTAR. 这些物镜通常用作观察荧光的物镜. 5.平场复消色差物镜基于平场消色差物镜，并且还可以校正第三色光的位置色差. 该物镜具有最佳的成像质量，其数值孔径大于相同倍率的物镜. 因此，判别率也最高，更适合于观察荧光. 镜头外壳上刻有PL APO字样（这种物镜是最高级的物镜）. （2）根据镜筒长度进行分类镜筒有限度的物镜的共轭距离（物镜距离）为195mm，物镜的机械长度（物镜的端面（后焦距）距目镜支撑面（目镜的前焦平面）的距离为160mm. 徕卡产品中的BME和CME使用这种类型的物镜. 2.镜筒无限远物镜在无限远处对物体成像. 因此，必须使用管形透镜将无穷远光聚焦到目镜的焦平面上进行观察. 徕卡产品中的DME，DMLS，DMLB等都使用这种物镜.

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