用于检测烟草青枯病的灯引物组及其使用方法_3

通过切割释放出DNA，并将所得液体用作LAMP的检测模板.

[0095]示例3: LAMP检测系统的建立

[0096]中所述的LAMP系统为25μL，在系统10×ThermoPolReactionBuffer 2.5μL，Bst DNApolymeraselyL，25 mMMgCl2 2μL，10 mM dNTPs 2μL，20μMFIP和BIP各自为2μL，5μMF3 B3和B3分别为1μL，10μMLF DNA和LB各为1μL无菌去离子水8. 5μL，将上述成分添加到PCR管中并充分混合，置于水浴中，在63°C孵育40分钟. 反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测到对照管未扩增，阳性样品出现梯形图（图1A）. 离心后，阳性样品（提取的青枯菌DNA）有白色沉淀（图1B）；当添加SYBRGreenI核酸染料时，阳性样品的反应产物变为绿色，而阴性样品的反应产物（阴性样品使用无菌去离子水作为模板，用作空白对照）为橙色（图1C）

[0097]示例4: LAMP特定检测

[0098]通过上述方法2，将泛菌，猕猴桃Canker，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，番茄Canker，Citrus Canker，水稻条纹细菌，水稻Xanthomonas oryzae的DNA用作模板，按照下述方法进行LAMP反应. 按照上述4中的反应体系和反应条件，以青枯菌DNA为模板作为阳性对照，无菌去离子水为空白对照. 反应完成后，进行凝胶电泳测试. 测试结果表明，以青枯菌DNA为模板仅出现梯形条带，空白对照和其他细菌DNA为模板未出现条带（图2）.

[0099]示例5 LAMP灵敏度检测

[0100]将通过上述方法2获得的青枯雷尔氏菌的DNA稀释十倍，以获得long /μL，lng /μL，100pg /μL，10pg /μL，lpg /μL，100fg /μLDNA的浓度，以10fg /μL，lfg /μL，0·lfg /μL为模板，根据上述方法4的最佳反应体系和反应条件，通过常规PCR检测进行LAMP的检测.

[0101]检测结果如图3所示: 图A为LAMP检测的电泳图，图B为SYBRGreenI染色后的目测结果，图C为常规PCR检测的电泳图. 其中M是DL5000DNAMarker； 1为空白对照； 2为10ng /μL; 3为lng /μL； 4是100pg /μL; 5是10pg /μL; 6为lpg /μL; 7是100fg /μL; 8是10fg /μL; 9是lfg /μL； 10为0·lfg /μL；可以看出，LAMP对青枯雷尔氏菌DNA的检测下限为lfg / yL，而常规PCR对青枯雷尔氏菌DNA的检测下限为100fg / yL. 从结果可以看出，本发明的LAMP引物和检测方法的检测灵敏度是常规PCR检测的100倍.

[0102]示例6: 实际样品的LAMP测试

[0103]通过根系灌溉方法（细菌浓度107cfu / ml，每株植物30ml）感染温室中生长的烟草植株一个月，感染5天和10天后，将其取下茎和叶柄（在此实验中，下部叶柄是最下部的2-3个真叶的叶柄；下部茎是最上部的2-3个真叶的茎的位置及以下区域. 在此实验中，上部叶柄是最低的2-3个真叶的叶柄;上部茎是最上面的2-3个真叶和以上区域的叶柄的茎的位置. ），茎和叶柄的维管束汁通过上述方法得到的维管束汁，将维管束汁加入到EP管中. 在沸水锅中煮沸5-10分钟，得到维管束汁作为模板. 使用常规引物RSol（R）/ RSol（F）和LAMP引物分别进行PCR扩增和LAMP扩增. 扩增产物被电泳. 检测.

[0104]采样方法: 取不同病害程度的烟草植株，切开烟草植株的茎和叶柄茄青枯菌，用解剖刀轻轻切开表皮，露出血管束（图5），挤压血管束，挤压将榨汁加入到EP管中. 如果果汁含量低，则可用无菌去离子水冲洗血管束. 冲洗后，添加EP管. 将EP管密封并置于沸水浴中，煮沸5分钟以破裂并释放病原体. DNA，所得液体用作LAMP的检测模板.

[0105]（1）常规PCR检测

[0106]以感染5天后的烟草植物的上下茎和叶柄的维管汁为模板进行PCR扩增. 引物序列为: R.sol: 5'-GCGGACGGATAGATGTAGTTGC-3'，R.sol（F）: 5'-CCGACACCACGACCCTGAA-3'. 电泳结果表明，仅下部茎汁可以用作模板扩增目标条带，而其他三个部分的组织汁中目标条带未扩增，这可能是由于青枯菌引起的. 感染. 烟草的这些部分或这些部分的青枯雷尔氏菌含量低，因此未能扩增目标条带（见图6）.

[0107]以感染10天后的烟草植物的上下茎和叶柄的维管束汁为模板，进行PCR扩增. 电泳结果表明，只有下部茎和叶柄的汁液可以作为模板扩增. 目标条带，上部茎和叶柄的汁液无法扩增目标条带，这可能表明茄形青枯菌还没有感染了烟草植物的上部，或者可能是上部组织中茄形青枯菌的浓度太低，无法通过常规PCR进行检测（参见图7）.

[0108]（？LAMP检测

[0109]以感染后5天的烟草植物的上下茎和叶柄的维管束汁为模板，进行LAMP扩增. 电泳检测结果表明，上下茎和叶柄的血管汁可能是一个特殊的梯形谱带扩增，但从上茎和叶柄扩增的谱带较暗，表明茄汁中Ralstonia solanacearum的浓度. 上层组织较低（见图8）.

[0110]将扩增产物用核酸染料SYBRGreenI染色并观察. 染色结果与凝胶电泳结果一致（见图9）.

[0111]将感染10天后烟草植物上下茎和叶柄的维管束汁液用作LAMP扩增的模板. 电泳检测结果表明（图10）: 上，下茎和叶柄的尺寸可以用特殊的梯形条带放大管束汁，亮度没有差异.

[0112]将扩增产物染色并用核酸染料SYBRGreenI观察（图11）. 染色结果与凝胶电泳结果一致.

[0113]同时，还对LAMP检测方法的检测效率进行了计数. 有关详细信息，请参见表2和表3. 可以看出，植物下部茎和叶柄的维管束汁更敏感. 感染10天后，检出率达到97％以上.

[0114]也可以从前述附图的结果看出. 由图6至图11可知，本发明的方法通过染色可以达到PCR电泳检测效果的准确性，非常可靠，具有广阔的应用前景.

[0115]表2感染5天后LAMP产品的SYBRGreenI染色

[0116]

[0117]表3感染10天后LAMP产品的SYBRGreenI染色

[0118]

[主权]

1. 用于检测青枯雷尔氏菌的LAMP引物组，其特征在于包括上游和下游外部引物，上游和下游内部引物以及一对环引物. 引物的序列如下: 上游外部引物F3: 5'-GCAGATCCGGAAGCTCAAG-3'；下游外部引物B3: 5'-GATGTGGGCCCTGGTCA-3';上游内部引物FIP: 5'-TGCGTGAACCCTTGTCCTGTCCAGGAGAGAGCCTGA GCGAA-3';上游内部引物BIP: 5'-CGACATCTGCCGGATCAGCCGCGCCA LF: 5'-AGGTGGTGTGATATTCTCGC-3';环引物LB: 5'-CAGACGGCAGTCGCTC-3'. 2.使用引物组检测青枯菌的方法，其包括以下步骤: （1）制备待测样品的DNA模板: 通过挤压烟草植物的茎和叶柄获得维管束. 待测果汁，煮沸后用作检测样品的DNA模板； （2）LAMP扩增: 所用酶为Bst DNA聚合酶，量为8U / 25y L系统；上游和下游外部引物，上游和下游内部引物和一对环引物之间的摩尔比为1: 8: 2；反应在63℃下终止40分钟. （3）LAMP检测结果: 在LAMP扩增产物中加入钙黄绿素，如果扩增产物变为亮绿色，则等待测试样品中含有青枯雷尔菌，如果扩增产物为棕色，则被测产物中不含有青枯菌. 或者，在LAMP扩增产物中加入羟萘酚蓝，如果扩增产物变为天蓝色，则说明该试验样品中含有青枯菌；如果扩增产物是紫色，则说明该试验产品不含青枯菌；或者或在AMP扩增产物中添加SYBR Green I核酸染料，如果扩增产物变成绿色，则测试样品中含有烟草青枯病；如果扩增产物为橙色，则说明产品中不包含烟草青枯病. 3.根据权利要求2的方法，其特征在于在步骤（3）中将SYBR Green I核酸染料加入到LAMP扩增产物中. 4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于: 在步骤（3）中将所述LAMP扩增产物离心后，添加染料用于染色判断. 5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于: 在步骤（1）中，所述植物下部的茎和叶柄的维管束汁；下叶柄是最下2-3片真叶的叶柄；下部茎是最低的2-3片真叶及其以下区域的茎的位置.

<专利>本发明属于植物病害检测技术领域，提供了一种用于检测烟草青枯病的LAMP引物组. 用于检测青枯雷尔氏菌的LAMP引物组包括上游和下游外部引物茄青枯菌，上游和下游内部引物以及一对环引物. 本发明的LAMP引物组和检测方法可以在短时间内准确地检测烟草植物中是否含有青枯雷尔菌，不需要昂贵的设备，并且可以用肉眼直接判断检测结果. 本发明适用于基层快速检测领域.

【IPC分类】C12Q1 / 68，C12Q1 / 04，C12N15 / 11

【出版号】CN105238876

【申请号】CN201510830057

【发明人】黄俊立，秦忠良，丁伟，李长军

[申请人]重庆大学

【开放日】2016年1月13日

【申请日期】2015年11月25日

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