CZE法鉴别和测定苦豆草药中各种生物碱

http: h hxtb.org化学通报2008年第6期？ 453？苦豆药材中各种生物碱的鉴定和测定的CZE方法范新荣田静李晓东1 2 13孙惠民12（1中国药品生物制品检定北京100050；中国药学杂志编辑部北京100022）摘要建立了同时鉴定苦参中9种生物碱和6种生物碱含量的电泳μ方法. 也就是说，使用50 m×4115cm（有效长度33cm）的未涂层熔融石英毛细管柱，使用013molΠL Tris水溶液2正丙醇（VΠV =60Π40，pH = 710）作为运行缓冲液，并使用氯雷那林作为内部缓冲液以毛细管电泳为标准，检测波长为210 nm，工作电压为30 kV，压力为50 mbar，进样10 s，工作温度为25℃，分析时间为40分钟. 结果表明，市售的宁夏苦参中含有靛蓝，山梨碱，槐定碱，苦参碱，槐定碱，槐定碱，槐定碱，氧槐定碱和氧化苦参碱，其中苦参碱，槐定碱，索拉林，羟槐定碱和氧化苦参碱的含量相近. 槐定碱明显高于他们.

此方法灵敏，准确且专一. 适用于苦豆草中生物碱的鉴定和含量测定. 关键词: 毛细管区带电泳生物碱苦豆子CZE苦豆碱中的生物碱鉴定与测定L.范新荣，田静，李晓东21213，孙惠民1（1国立药品生物制品检定所，北京100050;中国药学杂志，北京100022）摘要建立了同时鉴定苦参中9种生物碱并同时测定6种生物碱的CZE方法. 该方法在未经处理的熔融石英毛细管μ色谱柱上进行，色谱柱为m×4115cm（有效长度为33cm），色谱柱为50 V =60Π40，pH = 710，使用013molΠL Tris溶液2 n2丙醇（在30kV和25℃下运行的缓冲液）进行压力注入. 采用5kPa×10s，检测波长为210nm，内标物质为雷普林碱，鉴定了宁夏药材市场苦参中的9种生物碱，并用该方法测定了其中的6种. 苦参碱，苦瓜碱，苦参碱，苦瓜碱和苦参碱的成分相似，不同之处在于宁夏草药市场中苦参碱中苦参碱的含量明显高于其他方法，因此该方法灵敏，准确，专一. 苦豆碱中生物碱的含量测定关键词CZE，生物碱，苦豆碱. 苦豆碱是豆科植物的完整植物我种上夏天收获的苦豆.

味苦，凉，具有清热，利湿，止痛，杀虫等作用，分布于内蒙古，新疆，西藏等地[1]. 作为一种民族药，苦豆腐过去一直只适用于西北民间. 药理研究[4〜6]治疗肠炎，喉炎等杂症. 近年来，已发现它在各种医学疾病中具有催眠，抗癌，抗心律不齐，痢疾和提高白细胞的作用. 在外科杂项疾病中具有治疗痔疮和治疗手足癣的功效. [2]成分为生物碱，例如[3]苦参碱，槐定碱，槐定碱，槐定碱，氧化槐定碱，氧化苦参碱和槐定碱. 因此，从苦豆草中分离鉴定这些生物碱具有重要意义. 本文使用毛细管电泳（HPCE）中最简单，最基本，使用最广泛的分离模式之一: 毛细管区带电泳（CZE）用于同时分离和鉴定寻常苦豆中的9种生物碱成分并确定其中6种他们. 苦参的普通生物碱. 3联系人李晓东，男，35岁，博士，副研究员，副所长，从事药物验证研究，E2mail: xdli @ nicpbp.org.cn2008203218收到，2008204220被接受了吗？ 454？ 《化学通报》 2008年第6期http: Πhxtb. Org1实验部件111仪器和试剂Agilent G1600AX HP CE毛细管电泳系统；美国MILLIPORE公司超纯水发生器； Beckman 40 pH Meter3D酸度计.

由中国药品生物制品检定所提供的苦参碱，槐定碱，槐定碱，羟槐定素，氧化苦参碱，丙啉，索拉林，槐定碱，靛蓝碱和赖氨酸；三批次苦瓜药材购自宁夏药材市场，并经中国医药生物制品研究院中药所鉴定. 112实验方法μ11211电泳条件毛细管柱是安捷伦未涂覆的熔融石英毛细管50 m×4115cm（有效长度33cm），运行缓冲液是013molΠL Tris水溶液2正丙醇（VΠV =60Π40，pH = 710） ，检测波长为210nm，工作电压为30kV，工作温度为25℃. 在5kPa压力入10s，分析时间为40min，内标为氯丙嗪. 11212试验溶液的制备1）内标溶液: 在减压下精确称取适量的丙嗪参考物质，干燥至恒重，加水制成每1mL含015mg的溶液； 2）混合参比溶液: 精确称量并称取靛蓝，赖氨酸，槐定碱，苦参碱，槐定碱，槐定碱，氧化槐定碱，氧化苦参碱，氧化苦参碱参考物质和内标物的适量溶液，加水制成每份参试溶液011mg的溶液. 物质和1105毫克内标物； 3）样品溶液: 准确称取约2g苦瓜碎药材，并将其放入带塞子的锥形瓶中.

精确地添加018mL浓氨水测试溶液，放置015h，精确地添加25mL二氯甲烷，塞子，充分混合，摇动放置8h，然后取上清液并过滤. 以相同的方式再次浸泡两次，合并滤液并旋转干燥. 将残余物置于室温后，精确添加25 mL的2％盐酸溶液使其溶解，超声处理5分钟，放置8小时，然后过滤. 滤液用10mL萃取一次，弃去醚层，用饱和碳酸钠溶液将pH调节至9-10，然后加入氯化钠直至溶液饱和并过滤. 将滤液用二氯甲烷萃取3次，将萃取液合并，并蒸发至干. 精确地向残留物中添加10 mL水，摇动使其溶解. 摇动后，精确称量5mL，并放入10mL的量瓶中. 准确加入1mL内标溶液，用水稀释至刻度并摇匀，作为苦豆腐的样品溶液. 11213样品测定取每种参比溶液（即，上项中的每种储备溶液），混合参比溶液和每批苦豆样品溶液，以便进行注射和测量，以鉴别靛蓝，地利曼和淮安. 样品中有9种生物碱，如生物碱，苦参碱，槐定碱，槐定碱，氧健身蛋白，氧化苦参碱和氧化苦参碱. 采用内标法计算了样品溶液中苦参碱，槐定碱，槐定碱，氧化槐定碱，氧化苦参碱，氧化苦参碱等6种生物碱的含量.

2结果与讨论211线性范围称量苦参碱，槐定碱，槐花碱，氧代槐定胺，氧化苦参碱和氧化苦参碱的参考量，并向每1mL含水的水中加入水. 将2mg参考物质的溶液摇匀，用作储备溶液. 分别精确测量10、5、215、1、015、0125、011、0105和0101mL的每种储备溶液，并将其分别放入10mL量瓶中，向每种精密度加1mL内标溶液，加水稀释至标记，作为标准溶液摇匀. 样品进样，三次平行测定，浓度x（mgΠmL）与各组分峰面积与内标，苦参碱，槐定啶，槐定碱，氧化蝗虫的峰面积之比的平均值进行线性回归水果碱，氧化苦参碱和氧化苦参碱的回归方程为: y = 1413 x + 011，r = 019998； y = 1317 x2011，r = 019997； y = 1712 x + 011，r = 019993; y = 1817 x + 013，r = 019999； y = 2315 x + 013，r = 019995； y = 2213 x + 014，r = 019996.

结果表明，在01002〜2mgΠmL范围内，其浓度与峰面积具有良好的线性关系. 212检测限和定量限在电泳条件下，信噪比为3，上述六个生物碱的检测限分别为512、515、511、514、513和517ng. 信噪比为10时，其定量限分别为1418、1615、1511、1619、1513和1716ng. 213连续6次注入标准曲线中浓度最低和浓度最高的精密溶液和标准溶液. 在低浓度下，这6种生物碱的峰面积的RSD分别为111％，113％，112％和110％. ，112％和019％；高浓度时分别为018％和017％: http: ΠΠhxtb. Org Chemical Bulletin 2008第6期？ 455？ 019％，018％，111％和017％. 214样品回收率准确称取9份已知含量的苦豆草药粉（每份2g），并添加浓度苦参碱0112mgΠmL，槐定碱0147mgΠmL，槐定碱0109mgΠmL，氧槐定碱0110mgΠ8、8、8、8、10、10 ，10、12、12和12 mL的混合参比溶液，氧化苦参碱0114 mgΠmL和氧化苦参碱0112 mgΠmL放入装有塞子的锥形瓶中.

在相同样品下操作，六个生物碱的平均回收率经计算分别为9711％，9710％，9619％，9711％，9617％和9712％； RSD分别为211％和213％. 119％苦豆草，210％，212％和213％. 215反复取1批苦豆药，并按照11213节的方法并行制备5种测试溶液，并分别测定其含量. 确定的六个生物碱含量的RSD分别为118％，117％，115％，116％，119％和114％. 216稳定性取1颗苦味豆样品溶液，并将其放置0、2、4、8、12、24、48、72h进行进样测量. 六个生物碱的峰面积的RSD分别为115％，210％，116％，117％，114％和118％. 217样品的测定采用本文所述方法测定了从宁夏草药市场购买的三批苦豆草药样品. 混合参比溶液，3批苦豆样品溶液以及靛蓝，山梨碱，槐定碱，苦参碱，槐定碱，槐定碱，山梨碱，氧化苦参碱和氧化产物的分离模式图9显示了苦参碱等9种生物碱的鉴定.

图1 CZE分离图图1 CZE电泳图a: 参考物质； b: 第一批苦豆草； c: 第二批苦豆草； d: 第三批苦豆草1: 丙嗪林； 2: 槐定啶； 3: 槐花碱； 4: 槐花碱； 5: 槐花碱； 6: 槐花碱； 7: 赖氨酸8: 氧化的槐定碱； 9: 氧化苦参碱； 10: 从图1可以看出槐花生物碱，这三批槐花腺苷，赖氨酸，槐花生物碱，苦参碱，槐定碱，槐定碱，氧卡地平，九种生物碱，氧化苦参碱和苦参碱. 表1给出了苦参碱，槐定碱，槐定碱，槐定碱，氧茶碱和氧化苦参碱等6种生物碱的测定结果. 表1宁夏苦瓜Π％表中6种生物碱成分的含量. 1宁夏草药市场上槐豆中的六种生物碱的数量Π批次1 2 3苦参碱01057 01035 01041槐定碱01234 01132 01178槐定碱01043 01014 01032苦参碱01061 01019 01026氧代槐定碱01056 01041 01051氧化苦参碱01006 01054 01053总计01517 01295 01381？ 456？化学公报2008年第6期http: //Πhxtb.org从表1中可以看出，在这三批苦参中，槐定碱的含量明显高于苦参碱，槐定碱，槐定碱，羟槐定碱和氧化苦参碱等5种. 成分，这五种成分的含量相似.

不同批次苦豆草中6种生物碱成分的含量和总量均不同. 218讨论本实验的研究对象是除硫辛酸外的所有喹诺西啶生物碱，其化学结构非常相似，均具有2个氮原子，1个为叔胺，为碱性，1个为酰胺态且几乎为不是碱性的. 通常，它相当于带有一个离子的弱碱，其电离[7]常数（p Ka）接近812. 实验表明，当Tris和n-的混合溶液时，可以获得最佳分离效果. 丙醇用作运行缓冲液，并用磷酸将pH调节至7. 由于每批苦参的生物碱提取物在不同的保留时间出现了未知的峰苦豆草，因此选择比每种组分的峰更早的泼尼松龙作为内标. 参比物质和样品均以水为溶剂，达到了毛细管电泳“场放大累积”的效果. 采用流体动力学方法对各成分进行充分采样，并优化了工作电压和温度. [8] [8]为了从苦豆草药中提取生物碱，根据相关的专着和文献，我尝试了“氨法”，“乙醇法”，“水[9] [10]酒精提取法”并有“酸性水法” 4种方法. 经过比较，确定使用纯度更高，收率更高的“氨法”作为提取方法，并改进和优化了一些提取步骤，例如用低毒性的二氯甲烷代替氯仿，并优化了二氯甲烷. 甲烷的浸泡时间，2％盐酸的静置时间和二氯甲烷的萃取次数.

该方法的提取回收率良好. 通过检查每种生物碱组分的最大吸收波长，将210 nm用作检测波长，空白对照显示无溶剂干扰. 在鉴定每种生物碱成分时，每种单一参考物质的峰的保留时间和光谱与混合参考物质和样品中的峰相对应，并且鉴定了大多数色谱峰. 对于保留时间相似的两组色谱峰（槐定碱，苦参碱和槐定碱；氧化的槐定碱和氧化苦参碱），使用标准添加方法对其进行区分. 这样可以准确识别这九种生物碱成分. 分析结果表明，虽然不同批次苦豆草中6种生物碱的含量不同，但各组分的增减趋势基本相同，且9种生物碱的组成相同，表明这3批是整个宁夏出售的苦豆腐可能同样受到生长环境的影响，即原产地相同；但是由于生长时间和其他因素的不同，每种成分的含量是不同的. 参见[2]胡毅. 中华中医药信息杂志，1996，3（12）: 8-9. [3]常新权. 中药有效成分分析手册. 2002，学苑出版社，1323，1320，2041 [4]陶尚立，王敬振. 中国药学杂志，1992，27（4）: 201〜2041 [5]黄秀梅，李波. 中国药学杂志，2002，16（3）: 175〜178. [6]张琳娜，白洁. 宁夏医学院学报，2004，26（3）: 214〜217. [7]秦学功，袁迎进. 中草药，2001，32（7）: 604〜606. [8]中国科学院上海药物研究所. 提取和分离有效成分. 上海: 上海科学技术出版社，1983: 2551 [9]余锡水，关荣娟. 中成药，1990，12（3）: 3〜4. [10]张保贤，Ku应坤. 中国中药杂志，2000，25（5）: 607〜609. 检验文献［1］江苏新医学院. 中医大辞典（第一部分）. 上海: 上海人民出版社，1977: 12831

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