基于生物质谱的蛋白质C末端肽的表征和定量新方法

【摘要】: 本文主要研究蛋白质的C末端. 基于生物质谱技术，开发了一套新的蛋白质C末端富集，鉴定和相对定量的新技术和新方法，可用于高效，准确地揭示蛋白质C末端的生命信息，包括准确的C末端序列的确定以及C末端肽的相对定量，我们对蛋白质C末端在生命活动和蛋白质降解过程中的重要生物学意义有了更好的了解. 蛋白质的C末端在蛋白质的各种生命活动过程中起着极其重要的作用. 它不仅标志着DNA转录和翻译成蛋白质的过程的初步完成，而且参与并调节了蛋白质的各种生理功能. 然而，目前通过组学方法对蛋白质C末端的鉴定仍仅限于经典的质谱鉴定策略，并且还没有完整的方法来富集和鉴定蛋白质C末端. 为了鉴定中不存在的新的蛋白质C末端，目前的鉴定方法仍然很难实现. 因此，尽管蛋白质的C末端越来越受到关注，但迫切需要方法学上的进一步突破. 本文结合恶唑酮化学方法对蛋白质的C末端进行了专门标记，在此基础上，开发了一系列衍生化试剂，用于蛋白质C末端的富集，定性和相对定量，可以终身使用识别出体内内源性降解产生的新C末端，甚至进行从头测序. 此外，针对“自下而上”技术路线的关键步骤-酶解效率不足的问题，研制了一种物理吸附式酶解反应器，并对其工作机理进行了原则性的探讨.

因此，本文致力于建立一种有效且实用的新型C末端分析策略，以解决当今蛋白质C末端组学面临的技术问题. 本文工作的主要成果和突出贡献如下: 第一章绪论简要概述了基于大分子生物质谱技术的蛋白质组学研究对象及其研究意义. 基本介绍了目前广泛使用的定性和定量技术及其主要问题. 特别强调固定化酶水解反应器的详细描述，该反应器提高了酶水解过程的效率. 本文阐述了蛋白质C末端的研究意义和研究中面临的主要困难，并根据各种富集鉴定方法的原理对其进行了归类，归纳和总结. 最后，提出了本课题的目的和意义. 在第二章中，提出了一种基于恶唑酮化学的同位素标记新策略，以解决传统的生物质谱鉴定方法难以确认和鉴定蛋白质C端以及内源性新生成的C端的问题. 质谱无法鉴定蛋白质. 同时实现复杂生物样品中蛋白质C末端的鉴定和相对定量. 该方法结合了恶唑酮化学和轻，重双标记精氨酸同位素标记. 通过恶唑酮反应，精氨酸与蛋白质的α-羧基特异性结合. 进行蛋白水解后，带有同位素标记的C端肽在质谱图中将显示为一对峰，从而将其与其他酶促肽区分开. 通过进一步的串联质谱分析，获得了C末端肽的序列信息. 使用精氨酸作为衍生试剂可以增强C末端肽的碱性，并大大提高该肽在质谱中的电离效率.

此. 研究表明，两个数量级内都保持一致的线性和高重现性. 相关系数（R2）大于0.99，变化常数（CV）控制在11％以内. 随后，将该方法应用于腾冲嗜热菌的研究，并研究了在不同温度条件下培养的腾冲嗜热菌的蛋白C末端表达水平的差异. 总共成功鉴定出68个C末端肽，其中有53个在腾冲嗜热细菌中在两个温度下被鉴定出具有相对定量信息. 大多数具有不同表达的C末端肽均归因于各种酶蛋白，因此我们推测温度确实是影响腾冲嗜热细菌生物学活性的重要因素. 另过大的问题，这不是有利于质谱鉴定等问题. 逆向浓缩与正向浓缩策略相反.

基于恶唑酮化学，一种双功能试剂，一端带有生物素，一端带有精氨酸，与蛋白质的C端特异性结合. 酶水解后，标记的蛋白将通过链霉亲和素和生物素之间的亲和力特异性富集C末端肽. 这种富集策略可以大大降低样品的复杂性化学反应器吸附器，提高C末端的识别效率和识别通量. 首先，在标准肽和标准蛋白的水平上，探索和优化了恶唑酮反应条件和链霉亲和素富集条件，可以将标记反应的效率提高到90％以上，而且富集的特异性也很高. 确保当标记的肽和未标记的肽以1:50混合时，仍然可以获得良好的富集效果. 由于衍生化试剂包含精氨酸，因此可以增强C末端肽的碱性，从而大大提高了质谱中肽的电离效率. 此外，针对二级光谱中标记肽段的特殊片段化结果，还优化了蛋白质搜索方法. 标记的精氨酸和生物素还将在二级质谱图中显示类似于b，y离子的产物离子峰，但未在文库搜索中使用，因此我们将生物素设置为第21种氨基酸，并对蛋白质进行了修饰中，人为地添加了蛋白质C末端之后的精氨酸和生物素序列，以提高C末端肽段的质谱鉴定效率. 然后将该方法应用于实际样品的C末端检测，并选择腾冲嗜热菌作为模型生物. 经过3次技术重复，共成功鉴定出183个C末端肽，这比以前的鉴定要多. 数据规模已大大提高.

第四章从固定化酶水解反应器的角度出发，系统地解决了传统酶水解工艺中酶水解效率低和自降解的问题，导致整个工艺过程的灵敏度和效率较低. 深入讨论了物理吸附型酶解反应器的工作过程. 我们还考虑了静电相互作用和亲水疏水作用对物理吸附的不同影响. 首先，为此目的合成了一系列包裹有不同聚合物层的纳米硅球，并详细评估了不同纳米球在催化酶水解过程中的效率. 我们合成了涂有聚二烯丙基氯化铵（PDDA）和聚苯乙烯磺酸盐（PSS）的纳米硅球. 这两个硅球表面上的聚合物的电荷性质不同. 在酶促水解系统（25 mM碳酸氢铵，pH约为8）中，它们分别具有正电荷和负电荷. 尺寸和外观一致. 另外，合成了在表有疏水性有机长链的纳米硅球. 这些硅球在酶解体系中保留了原始硅球表面的负电荷，并且在水溶液体系中还具有疏水性. 不同的材料用于标准蛋白细胞色素C和卵清蛋白的酶促水解. 这两种蛋白质在酶促水解溶液系统中具有不同的电荷，但它们都是疏水性蛋白质. 我们发现，不同材料对具有不同等电点的蛋白质的酶解效率有显着差异.

因此，静电效应确实是吸附过程中的决定性驱动力. 在存在静电相互作用的情况下，亲水和疏水作用仅仅是次要因素. 如果蛋白酶和要水解的底物蛋白均对材料带有相反的电荷，则在静电相互作用的影响下，它们可以同时吸附在固相载体的表面，从而改善了蛋白酶及其周围的局部区域. 材料. 蛋白质的浓度使酶解过程在更短的时间内达到平衡，并提高了酶解效率. 另一方面化学反应器吸附器，如果酶和底物都带有不同的电荷，则它们不能总是同时被一种材料吸附，因此，与传统的溶液酶解相比，这种吸附酶解反应器的效率无法提高. 除了确定物理吸附型酶解反应器中决定性的吸附因子外，还对吸附-酶解的动力学过程进行了基础研究. 我们发现，不管它们是被不同的电荷吸引还是被相同的电荷排斥，都始终可以在短时间内达到基于静电相互作用的吸附平衡，因此，如果将酶水解反应器视为吸附-酶水解反应，在一级反应的情况下，蛋白质消化过程是整个吸附消化反应的决定性步骤. 这将在今后酶水解动力学的进一步研究中起到很好的指导作用，为下一代吸附式酶水解反应器的开发奠定一定的理论基础和指导. 综上所述，本文将恶唑酮化学与各种标记试剂结合作为开发蛋白质组学C末端研究相关新技术的技术手段，重点研究蛋白质C末端鉴定和富集研究中的热点和难点问题. 和实际应用研究旨在建立一种将化学衍生标记物应用于质谱分析的策略，从而为解决蛋白质组学中C端肽的富集，鉴定，质谱鉴定和相对定量提供一种新颖而有效的方法. 研究方法和方法.

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